Merkel细胞多瘤病毒大T抗原(LT)、截短的大T抗原(LTtr; MCC350)和小T抗原(sT)对初级新生儿人类真皮成纤维细胞(nHDFs)中的mRNA水平的影响

1: 概要: 此部分讨论研究的优点/缺点、新颖性/意义、总体执行和学术性。

1. 研究了Merkel细胞多瘤病毒大T抗原(LT)、截短的大T抗原(LTtr; MCC350)和小T抗原(sT)对初级新生儿人类真皮成纤维细胞(nHDFs)中的mRNA水平的影响。病毒cDNA通过慢病毒(sT-IRES-mCherry)和LeGO-iG2(LT/LTtr - eGFP)转导，然后在第2天为荧光蛋白排序，然后在d3和d8进行分析。虽然LT诱导了DNA复制基因，但sT的表达似乎减少了干扰素相关的基因。ISGF3成分和下游靶标的mRNA水平都减少了，这意味着sT在上游发挥了其效应。值得注意的是，sT通过RT-qPCR和免疫荧光染色证明了IRF9 mRNA和蛋白的水平降低。为了验证sT对I型IFN信号基因的影响，他们在H1299和HEK293细胞中进行了启动子报告者测定。他们观察到，当与TBK1、IRF3、RIG-I、cGAS和STING共转染时，sT减少了IFN-B1报告者的活性。基于这些结果，作者提出sT干扰TBK1对IFN-B1报告者的信号。然而，除了启动子报告者测定外，没有直接证据表明sT干扰TBK1。图9中的卡通图暗示sT直接影响TBK1，但至多，下游有一种效应，TBK1似乎在sT存在时更不容易诱导转录反应。
2. 在这篇论文中，作者发现Merkel细胞多瘤病毒小肿瘤抗原(sT)可能通过在IFNB1上游，可能是在TBK1水平上，抑制干扰素刺激基因(ISG)的表达，从而有了一个潜在的新功能。他们通过转导新生儿人类真皮成纤维细胞(nHDFs)（一个可能的宿主细胞）与编码sT、大肿瘤抗原(LT)和一个来自病毒阳性Merkel细胞癌肿瘤的截短LT变种(LTtr)的慢病毒颗粒的组合，开发了一个新的MCPyV感染模型。他们在sT和LT以及sT和LTtr表示早期和晚期感染的两个不同时间点后，模拟肿瘤发生进行了RNA测序分析。他们发现了数百个与ST/LT/LTtr表达有关的差异表达基因，涉及不同的基因本体和生物过程。有趣的是，他们观察到sT导致I型IFN反应基因和先天免疫基因的显著下调。sT下调的基因与巨噬细胞中的ISGF3调节基因有很强的重叠，这表明sT抑制了ISGF3复合体的功能。他们接下来表明，sT减少了活跃转录的组蛋白标记(H3K4me3和H3K27Ac)在sT下调的先天免疫基因中，但对抑制性组蛋白标记(H3K27me3或H3K9me3)的影响很小，这表明sT阻止了这些基因的转录，而不是诱导表观遗传沉默。后续实验表明，sT在nHDFs中下调了ISGF3复合体的一个亚基IRF9的水平。通过在H1299和293细胞中进行的荧光素酶报告者测定实验，作者表明sT似乎不抑制对IFNB1刺激的ISGs的转录，这表明sT在IFNB1和ISGF3的上游起作用，与他们在nHDFs中的先前结果相矛盾。他们表明sT阻止cGAS-STING、RIG-I和TBK1介导的IFNB1-luciferase报告者的诱导，但不阻止组成活性的IRF3介导的诱导。他们得出结论，sT在TBK1水平上作用，下调IFNB1的表达，从而导致ISGs的下调。返回nHDF感染模型，作者观察到，LT在早期时间点瞬时上调IFNB1和ISGs，但在后期时间点没有持续。sT单独下调ISGs，在早期时间点减弱了LT介导的ISG诱导。作者得出结论，他们已经确定了sT的一个基本的新功能 - 在MCPyV感染期间阻止LT诱导的I型IFN调节基因。
论文以该领域当前知识的详细回顾开始，做得很好。该论文提出了一个有趣的观点，即sT对抗由LT引起的天生免疫应答，且评审者赞赏作者研究sT和LT单独和结合使用的努力。然而，存在几个主要问题，使得论文的结论值得质疑（参见第二部分）。该论文对sT如何下调ISGs的机械性理解非常有限且令人困惑。H1299/HEK293细胞的luciferase实验和nHDFs中的实验结果存在冲突，作者并未解决或解答这一问题。sT通过与NEMO结合调控NF-kB信号传导，这可能有助于ISG的下调，但作者并未提及。作者也未提及他们的LT构造可能表达的ALTO的贡献。因为目前需要进行多次主要的修订，所以这位评审者建议拒绝当前形式的论文。
3. 本研究探索了MCPyV（Merkel细胞多形性病毒）T抗原，特别是sT、LT和LTtr，对初生人皮肤成纤细胞（nHDFs）及随后的上皮源性细胞系的影响。现有的研究MCPyV的体外模型在捕获病毒生命周期的所有方面上都有很大的局限性。本研究使用慢病毒转导在nHDFs中过表达T抗原，以模拟初次感染以及在癌症中的整合后的早期和长期病毒基因表达，并研究了基因表达的变化。虽然sT的表达增强了细胞增殖和趋化相关基因，但它抑制了许多基因，包括LT和LTtr上调的一些基因。值得注意的是，它还抑制了I型干扰素（IFN）应答基因和MHC I类基因。这种效应与激活基因相关的改变的组蛋白标记相关。研究表明，sT对基因表达的影响与干扰素刺激基因因子3（ISGF3）复合物无关，主要在激酶TBK1的水平上破坏了I型IFN信号途径。研究有助于理解MCPyV对宿主细胞基因表达和免疫逃逸策略的影响。总体来说，这是一篇写得很好的稿件，对生成的数据进行了彻底的分析。然而，下面还有一些详细的担忧。

1. 主要问题：为接受所需的关键实验: 请使用此部分详述应绝对要求的关键新实验或对现有实验的修改，以验证研究结论。

   1. • 图1C中的热图在每个时间点只显示一个复制品。不清楚进行了多少RNAseq复制品。每个病毒结构和控制是否都只进行了一次复制品？所有构造体都在两个供体中进行了测试吗？图S2G中的PCA图表显示两个供体细胞的转录谱之间存在很大的差异。观察到的基因表达差异（表1）是否反映了两个供体细胞？这些值是否反映了两个或更多的复制品？

      • 图5：H3K27me3和H3K9me3的差异似乎不是很大（5C），也许是因为这些标记的水平较低，所以5B中的相关图与低r值有些误导。或许列举sT下调的特定基因对于测试的每个组蛋白标记会更有说明性。图5C的颜色编码丢失了。执行了多少ChIP-seq复制品？供体1和2都进行了描述吗？

      • 图7：对于IFNB1启动子报告酶测定，sT或V5-sT似乎减少了TBK1、IRF3-5D（持续活跃）、cGAS-STING和RIG-I-N的共转染的影响。sT是否影响这些共转染蛋白的水平？TBK1、IRF3-5D、cGAS-STING和RIG-I-N的Western印迹可能会有用。尽管sT在IRF3-5D存在下的效果不显著（图7D），但活动呈下降趋势。这次测定的结果是否认为sT对TBK1的影响与IRF3没有显著区别？

   2.

   * 在图1C中，sT、LT、LTtr、sT+LT 和 sT+LTtr 的 RNAseq 数据并排展示，允许轻松比较不同基因和簇，以及它们是上调还是下调。令人惊讶的是，图1B中的印迹是在单独的印迹上运行的，这只能确认某种病毒蛋白是否被表达。无法比较sT在sT单独和sT+LT或sT+LTtr中的表达，限制了读者解释每种蛋白对基因表达变化的相对贡献的能力。审稿人建议作者在相同的凝胶上重复运行这些印迹，以所有条件和给定供体的时间点，以便可以对每种条件下的相对sT/LT表达进行比较。
   * 作者提到IFNB1受NF-kB信号调控，并引用了两篇显示sT调节NF-kB活性的文章（Griffiths等人，2013 & Abdul-Sada等人，2017）。然而，作者并没有评估sT调节NF-kB途径对sT调节IFNB1和ISGs的贡献。目前尚不清楚作者是否发现了sT的全新功能，还是他们的观察结果是sT抑制NF-kB信号的结果。应该使用不与PP4C/NEMO结合的sT突变体进行额外实验，以评估NF-kB信号对ISG由sT调节的贡献。
   * 作者提供了来自nHDFs、H1299和HEK293细胞的冲突数据，但在论文中并未解决。在图6A中，作者显示了nHDFs在3和8 dpt的STAT1和IRF9 mRNA水平显著下调，并在图6C中显示了8 dpt的IRF9蛋白下调。审稿人对于为什么在图6C中对未分类的nHDFs 2 dpt进行印迹感到困惑，因为这些细胞与图6A或图8中之前分析的任何其他时间点都不相关。审稿人希望看到nHDFs在3和8 dpt的STAT1，p-STAT1和IRF9印迹。到目前为止，图6中的数据并不支持结论“MCPyV sT抑制ISG转录而不针对ISGF3复合物”。所示数据表明，sT确实通过下调IRF9 mRNA和蛋白以及可能的STAT1来抑制ISGF3复合物的活性。还应该解决STAT2的水平。
   * 在图7A/B/C中，作者在H1299细胞中进行荧光素酶实验，观察到sT并不抑制对IFNB1治疗的hIFIT1-/hIFIT-2/mMX1-荧光素酶报告基因的下调。鉴于此前显示sT在nHDFs中下调ISGF3活性，这些结果令人惊讶。在图8中，作者展示了数据，表明sT在nHDFs的3和8 dpt中下调IFIT1，IFIT2和MX1。sT在H1299细胞中是否像在nHDFs中那样下调STAT1，p-STAT1或IRF9？sT对hIFIT1-/hIFIT-2/mMX1-荧光素酶报告基因在没有IFNB1的情况下有任何影响吗？审稿人认为H1299细胞并不是一个好的模型系统，以剖析sT如何调节ISGs。
   * 在图7D中，作者评估sT调节IFNB1启动子活性的能力，使用通过与持续活化的磷酸模拟IRF3 (IRF3-5D) 或wt TBK1共转染刺激的IFNB1-荧光素酶报告基因。他们观察到sT不阻止IRF3-5D激活IFNB1-荧光素酶报告基因，但确实阻止了TBK1介导的IFNB1-荧光素酶诱导。众所周知，TBK1可以激活IRF3和典型的(p65/RelA) NF-kB信号，IRF3和NF-kB都可以驱动IFNB1的表达。作者确实承认IFNB1启动子包含NF-kB结合位点。已经显示TBK1可以激活IKK复合物，sT已被显示可以通过与NEMO结合来结合并抑制IKK。审稿人希望看到sT与NF-kB信号相关的突变体对IFNB1启动子的影响，以确定本文的发现的新颖性和重要性。
   * 在Fig7F/G/H中，作者从H1299切换到293细胞，因为“cGAS-STING的过表达或持续活化的RIG-I-N在H1299细胞中没有导致足够的报告基因诱导”。这些发现再次加强了H1299细胞不是研究sT调节ISGs的好模型的观念。审稿人欣赏作者重复了实验，以测试sT对TBK1介导的IFNB1-荧光素酶在293细胞中的激活的影响，但想知道他们为什么没有重复IFIT1/IFIT2/MX1荧光素酶结果在293细胞中，并建议他们检查sT是否下调IRF9、STAT1和p-STAT1。
   * 最后，作者将注意力集中在sT和LT上，这是MCPyV早期蛋白中的两种。作者没有引用ALTO (Carter等人，2013)。已经显示ALTO是在LT的第二外显子上过度打印的，并在正常的病毒生命周期中被表达。Yang等人（2021）显示ALTO可以刺激各种荧光素酶报告构建，表明ALTO对基因转录和表达有影响。除非他们评估他们的LT和LTtr慈善病毒构建是否编码ALTO，否则关于LT对转录的影响的结论会受到质疑。
   * 总之，作者在重新提交之前需要解决的三个主要问题是：
       - sT是否针对ISGF3复合物，如果是，是如何做到的？在nHDFs中的数据表明它确实如此，但并没有解决如何下调IRF9和STAT1 mRNA。
       - sT是否通过一个与其通过结合NEMO调节NF-kB信号的能力无关的机制来下调ISGs？
       - LT和LTtr构建是否表达ALTO？如果是，那么LT刺激ISGs的结论可能是不准确的。

   3.

   * 该研究适当地指出，不同的细胞类型可能会对病毒蛋白产生不同的反应，特别是在研究的天然免疫应答，如BKPyV和JCPyV在各种细胞类型中所见。然而，该研究使用源于上皮的H1299和HEK293来研究RNA-测序的发现，却没有任何理由。后者细胞系还包括腺病毒E1A，这也可能影响这些途径的信号。从nHDFs中IRF9定位的代表性IF图像来看，sT存在与对照和未转导的情况相比，可能存在改变的定位，或者这是由于成像过程中曝光设置不一致导致的。考虑到该研究指出，“由于cGAS-STING的过表达或RIG-I-N的固有活性在H1299细胞中没有导致足够的报告基因诱导”，荧光素酶和IRF9实验应在更合适的细胞系中重复进行。
   * 虽然纤维细胞明显容易受到MCPyV感染，但这些是否是MCC的起源细胞类型尚不清楚。对于UV介导的、病毒阴性的MCC，基于MCC/SCC的联合形态与共享的主干突变，上皮细胞几乎被证实是前体。考虑到这一点，以及上面提到的实验已经在上皮源性细胞中进行，使用sT、LT和LTtr对初级角质细胞进行慈善病毒转导实验将更好地解决nHDFs的观察结果有多通用的问题。

3: 次要问题：编辑和数据呈现的修改:请在此部分提供编辑建议，以及对现有数据进行相对较小的修改以增强清晰度。

1.
    * 为供体1显示的生长曲线（图S2F）显示了LT +/- sT的缓慢生长率，尽管在转录组配置文件中没有观察到明显的差异。出乎意料的是，结合的sT和LTtr增长速度最慢。供体2观察到了类似的动力学吗？
* 图3A。火山图可以显示小T抗原的表达
2.
    * 该论文可以从额外的校对中受益，因为某些短语和标点符号使用的英语不是标准的。
    * 为什么在图7的荧光素酶实验中同时使用了sT-V5和sT？文本中没有解释。
    * 选择了一个trLT变体 - 它是否代表所有其他MCC trLTs？
    * 在所有的图中，标签应该得到改进，以便读者可以看到哪个细胞系和哪个T-抗原正在被表达，以及在什么时点收获细胞，而不必阅读图例。特别是，图3A（哪个构造，nHDF sT？），图7（哪个细胞？它在子图之间改变，所以需要额外说明在哪里使用了哪个细胞系）。
    * 图7F/G/H中的印迹被裁剪，使读者无法比较印迹之间的肌动蛋白表达水平。应该在同一张印迹上重新运行印迹，将样本放在上面。
3.
    * 第138-140行：句子笨拙且不清晰
    * 该研究应列出每个样本生成了多少读数。
    * 为什么MACS2和SICER用于不同的组蛋白ChIP seq？
    * 使用了所有软件的什么版本？
    * ChIP seq实验生成了复制品吗？